基因编辑的未来

在19世纪，瑞士军队为一名多功能口袋刀合同，为官员携带领域。除了具有短刀片外，紧凑型小工具还采用折叠件开罐器，两种工具对于维持标准发行瑞士步枪至关重要：螺丝刀，用于拆卸和重新组装清洁枪支，以及用于清洁的枪械smooth burrs in the gun’s metal barrel. Today, the Swiss Army knife comes in dozens of models, each featuring tools curated for a particular audience—gardeners, hunters, locksmiths, even oenophiles.

这个标志性的工具也是CRISPR的一个类比。30亿年以来，单细胞细菌利用CRISPR-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeatmic来防御病毒的攻击。2012年，科学家们证明了CRISPR可以被重新编程来修改真核生物的DNA。想想精密手术刀、基因消音器、基因放大器，以及像现代瑞士军刀一样不断增加的额外工具。

在瓦杰洛斯医师和外科医生学院，CRISPR已经成为发现的支柱，基础科学家开发了新的基于CRISPR的工具，而翻译研究人员使用这些工具，揭示了对人类疾病及其管理的新见解。

“核心主题有很多变体，”他说山姆斯特恩贝格，博士，生物化学和分子生物物理学助理教授，他与他的博士顾问，Crispr Pioneer Jennifer Doudna-Advanced The Swiss Army Knife类比“创作中的裂缝：基因编辑和控制进化的不可想象的力量这本250页的书讲述了CRISPR的发现及其对生命科学的影响。

来自细菌的课程

作为研究生，斯特恩伯格与杜德纳合作开发了最早的基于crispr的工具之一。自2018年加入哥伦比亚大学以来，Sternberg扩大了他的研究范围，寻找在自然界最早的生命形式中发现的其他基因编辑系统，并详细介绍了如何部署它们来推进实验室中的基因组发现。他说:“细菌对抗病毒已经有很长一段时间了，它们免疫系统的多样化是构建新技术的宝库。”“我们还没有发现新的生物学，我们发现的越多，我们就可以利用更多的工具开发。”

这项工作是从被称为原核生物的主要单细胞生命形式开始的，这种生物没有细胞核或其他专用的细胞器。由于DNA在细胞质中自由漂浮，原核生物不能草率地检测和中和可能导致它们毁灭的外来基因。进入先天DNA监测工具，作为一个多变的适应性免疫系统。每当细菌击败致病DNA时，它就会捕获一些有特征的片段——那些有规律间隔聚集的短回文重复片段——然后生成一个RNA拷贝，这在基因上相当于通缉海报。随着细菌的适应性免疫系统继续监视原核细胞的细胞质，它仔细阅读那些一摞摞的通缉令。在确认身份的情况下，它使用crispr相关蛋白质(简称Cas)，就像一把精确的手术刀，建立起快速而有力的防御，将有害的DNA剪成碎片，阻止入侵者前进。

CRISPR完全改变了生物学家研究生物学的方式。它给了基础科学家的新的和更有力的问题，就像询问问题一样，“什么基因涉及癌症成为转移性？”并开启了新的药物发展途径。

真核生物——从真菌到人类——拥有一个包含和保护DNA的细胞核，这使得靶向基因修饰成为一项耗时且技术上具有挑战性的事业。技术人员利用化学物质、电流、病毒和微吸管的组合，突破细胞膜，进入细胞核，诱导dna断裂——所有这些都不会杀死细胞。然后它们依靠同源修复，一种细胞用来修复断裂DNA链的先天质量控制系统。(这很像修补一条牛仔裤:如果修补的地方和洞的边缘相吻合，那么这条缝就能保持住。)

例如，近几十年来的技术创新——基因测序、细胞克隆、RNA干扰、锌指核酸酶技术和转录激活物样效应器核酸酶——让科学家能够更好地控制自己的修补工作，使他们能够打开或关闭目标基因，创造“敲入”或“敲除”动物。然而，CRISPR具有改造性，允许科学家在活细胞的细胞核内的特定位置切割和粘贴DNA链。首先，他们创建了一个CRISPR RNA，其中包含目标基因序列的片段。然后他们将其与Cas酶一起注入真核生物的细胞核。Cas定位于RNA指定的位置并诱导双链断裂。

“CRISPR-Cas免疫系统已经完全改变了生物学家研究生物学的方式，”Sternberg说。“它给基础科学家提供了一种新的、更有力的方式来问这样的问题，‘哪些基因与癌症的转移有关?并为药物开发开辟了新的途径。在校园里，人们把CRISPR作为设计实验的更好方法。”

CRISPR加速科学

神经科学家Siegelbaum史蒂文博士，已经花了几十年来挖掘HCN1的机制，该基因用作人皮层内的电气起搏器，该脑的一部分负责更高思维过程的脑。近年来，基因组 - 范围的协会研究具有涉及婴儿和儿科癫痫形式的HCN1突变，不能通过头部损伤，感染，代谢紊乱或其他临床证据来解释。在某些情况下，癫痫发作是如此严重，它们导致进步性脑功能障碍和发育延误。

为了开发能够揭示这些突变如何造成如此严重破坏的小鼠模型，Siegelbaum和副研究员比娜澳网博士他是Siegelbaum实验室HCN1研究的长期首席研究员，转而研究CRISPR。Santoro说：“这非常快，比传统的引入点突变的方法相对便宜，而且在人类患者中有很多这种突变影响HCN1基因的不同部分。”。“我们不仅想产生一个小鼠系，还想产生一组HCN1基因的突变，这些突变也存在于人类患者中，以观察小鼠在多大程度上复制了人类的状况。”

使用支持哥伦比亚精确医学倡议哥伦比亚转基因小鼠共享资源的计划和专业知识，Siegelbaum和Santoro已经开发出四条小鼠，其中包含HCN1突变和癫痫发作，并开始分析其大脑的形态，用于初步线索关于突变如何影响脑解剖学和生物化学。“在最好的情况下，您可以使用Crisprp，也许12到18个月省一年，具体取决于您的技术如何，”Siegelbaum说。“原则上的一般证明，这些突变导致癫痫发作，很快就会发生。”

对突变引起的蛋白质改变影响大脑电活动的机制的更深入的了解将需要相当长的时间。“通过使用CRISPR，我们知道HCN1突变是我们实验小鼠中唯一的突变，”他解释道。“如果他们也会癫痫发作，这就有力地证明了这种突变是疾病的一个原因，而不仅仅是相关的。这就是我们的目标:我们想证明是患者体内的HCN1突变导致了这种疾病。”

通过同时探索多种HCN1变异及其在癫痫发作中的作用，Siegelbaum和Santoro还希望深入了解关于癫痫的一个基本难题，即癫痫发作有多种形式，可以改善一些患者症状的药物会加重另一些患者的病情。桑托罗说:“如果我们能在小鼠身上将不同的突变与不同种类的癫痫联系起来，那么我们就能看到哪种突变对哪种药物反应更好，或者哪种药物会加剧哪种疾病。”

像西格尔鲍姆和桑托罗，洛林克拉克博士他混合了全基因组关联研究、基础生物化学和功能研究，以及小鼠模型，以揭示基因变异如何影响大脑功能。她的研究重点是帕金森和特发性震颤等神经退行性疾病。

科学家们已经知道，p.E326K，一种葡萄糖脑苷酶(GBA)基因的特殊变体，与戈谢病的严重程度有关，是帕金森病和路易体痴呆最常见的风险因素之一。研究表明，这三种情况的共同问题与GBA如何编码对溶酶体功能至关重要的酶有关，溶酶体是负责细胞消化和废物清除的细胞器。但是科学家并不了解p.E326K破坏酶产生的具体机制。如果没有这一关键的洞察力，改善症状的靶向疗法仍是遥不可及的。

为了了解有关P.E326K如何改变溶酶体功能的更多信息，Clark正在将哥伦比亚精密药物序列与NIH的R03奖相结合，以产生具有基因变体的小鼠模型，以便表征由此产生的脑病理学。“CRISPR是具有成本效益，方便，易于使用的，”克拉克说。“确定与P.E326K相关的疾病机制可能开辟新的治疗靶标，可能对帕金森病和痴呆症与雄鹿体产生重大影响。”

创建新的CRISPR工具

Alex Chavez，MD，PHD他是病理学和细胞生物学的助理教授，花了大约一半的时间研究CRISPR的工作原理，试图使其更加有效。他获得了十几项专利；其中10项采用CRISPR技术。今年春天，哥伦比亚为他的工作提交了第一份专利申请，以快速生成数百个细胞系，每个细胞系都有针对性的突变。“我们花费大量时间的工具之一，”他说，“是改进我们如何使用CRISPR打开和关闭基因。”

当没有开发新的基于crispr的工具时，查韦斯使用这些工具来研究癌症和神经病理学。通过激活和抑制与阿尔茨海默病有关的基因，他希望揭示每个基因在疾病过程中的作用。特别是，他已经锁定了帮助神经元细胞耐受阿尔茨海默病和其他一些神经退行性疾病中受到干扰的蛋白质的基因。健康的神经元细胞有无数的方法来保护自己免受有害蛋白质的伤害，包括细胞凋亡或程序性细胞死亡。查维斯想找到既能缓冲错误折叠蛋白质影响的基因，又能放大错误折叠蛋白质影响的基因。他说:“我们正在寻找拉动哪个杠杆。”“没有什么是孤立的。你需要了解这些联系，才能拆解这个系统。”

CRISPR衍生的基本生物学也是如此。为了促进对如何最好地利用生物学来完善现有的工具和构建更好的工具的理解，一批初级教员定期召开会议，审查他们实验室中正在进行的项目，并排除技术上的挑战。他们称自己为SLCC(发音很滑头)，即Sternberg, Lu, Chavez和Ciccia。“每个人都有不同的视角，”斯特恩伯格说。赵璐，博士他的研究重点是表观基因组——开启和关闭基因的蛋白质。阿尔贝托Ciccia博士，也是遗传学与发展助理教授，研究修复DNA损伤和保持基因组完整性的机制。斯特恩伯格说:“我们每个人都从一个独特的角度思考科学——只有这样才能实现智力上的协同。”

今年6月，《自然》杂志发表了来自哥伦比亚斯特恩伯格实验室的第一篇论文——一篇关于如何在这种细菌中发现类似crispr的系统的报告霍乱弧菌可以在不先在目标DNA上炸一个洞的情况下，将遗传物质插入一个精确的位置。这个被称为“整合”的新系统依赖于被称为转座子的寄生“跳跃基因”，它可以使用一种类似分子胶的酶将自己插入DNA链。Sternberg说:“与引入DNA断裂并依赖细胞修复断裂不同，整合直接将用户定义的DNA序列插入基因组的一个精确位置，这是分子生物学家几十年来一直在寻求的一种能力。”

CRISPR伦理

即使科学家们在科学家发展更高级的基于CRISPR的工具，也可以使用它们来增加人类疾病的理解以及如何对待它，问题安装。“科学家一直在积极讨论更具技术问题，”斯特恩伯格说，“但在社会和道德方面，我们需要更多的人存在，包括将受影响的众议员，疾病倡导群体，疾病倡导群体，只想明白这一点的所有条纹的人。“

为了促进这样的对话，斯特恩伯格把校外听众作为一项高度优先事项。“我在这里的部分职责不仅是在实验室里培养博士后、研究生和本科生，”他说，“而且也要参与教育其他人。”为此，他在实验室里接待了来自纽约大都会区的来访高中生，并参与了一个利用网络会议将全国各地的科学家与教室联系起来的项目。今年春天，他还参加了“科学品味”(Taste of Science)项目，该项目邀请科学家们在当地的酒吧谈论他们的研究。斯特恩伯格与纽约基因组中心的一名科学家在东村的一家酒吧讨论了CRISPR。斯特恩伯格说:“有些人绝对没有涉足过研究实验室，但他们很好奇。”“他们想知道CRISPR可以如何使用，想要思考公司将如何应用这项技术，什么是道德的，什么是安全的，等等。”

伦理学家Paul S. Appelbaum医学博士早在CRISPR出现之前，他就在探索基因修饰的伦理问题。当他发射哥伦比亚号的时候精神、神经和行为遗传学的伦理、法律和社会影响研究中心在美国，CRISPR仍然是单细胞生物中观察到的一个晦涩的现象。但在2018年11月，就在第一篇详细阐述CRISPR如何用于修改真核细胞的论文发表6年后，中国科学家宣布，当月早些时候出生的一对双胞胎女孩的基因组已经使用该技术进行了修改。

虽然中国的案例引发了无数关于人类基因编辑的技术和伦理问题，但阿佩尔鲍姆认为CRISPR提出的核心问题是：特定的修改是随着个体死亡还是可以传给下一代。“我们是一方面治疗个别患者，”他问道，“还是寻求影响下一代以及以后的后代的干预措施？它们具有非常不同的伦理含义。”

目前各国的监管环境各不相同，人类基因修饰的合法性在很大程度上取决于临床医生的地理位置，这增加了在本国受到限制的科学家可能搬到监管更有利的环境的可能性。而且，对于可能用于制定CRISPR使用方式的国际标准的机制，目前还没有达成共识。“有各种各样的可能性，”Appelbaum说。“你可以有立法来控制或禁止CRISPR或其他基因编辑技术的使用，你可以有研究团体自愿的自我监管，或由资助人实施的规则，或一个完全不受监管的环境，研究人员和临床医生可以自由地使用现有技术做他们想做的事情。”

随着技术的进步，阿佩尔鲍姆预计社会将被迫面对关于人类意味着什么的深刻问题。他提出，“假设我们可以从人类基因库中识别出应该被剔除的条件，假设这是可能的，对于许多条件来说，异质性的基础是不太可能的，这是一个真正的问题。”自闭症谱系中的一些人在数学方面表现出的巨大创造力，或是受情绪障碍困扰的艺术家的文化贡献。“有神经多样性的问题，”他说，“但同样的基因，同样的变异可能会产生多重后果，特别是当我们谈论复杂的特征时。”而且，他指出，可能不可能完全理解我们面临的选择。“随着我们开始能够编辑基因库，我们可能无法预测我们正在进行的改变的一些后果。”